Пероксиды, часть 2. Мы все учились понемногу (28.07.2020)

12
Пероксиды, часть 2. Мы все учились понемногу (28.07.2020)

Вчера мне Маша приказала

В куплеты рифмы набросать

И мне в награду обещала

Спасибо в прозе написать.

(А.С. Пушкин, «К Маше», 1816)

 

Если кто помнит, история началась два года назад. А так как я люблю перекиси, тот очерк был написан с душой. Как ни странно, но и на такую специфическую тему нашлись интересанты, а кое-кто воспринял ее настолько ответственно, что решил создать и собственное производство. Шучу, конечно, одно с другим никак не связано.

Были вопросы и от моих ближневосточных коллег, учились мы вместе, а так как люди они скромные, то будем писать о них, как в стихотворении М. Исаковского «…В каждой строчке - только точки, - Догадайся, мол, сама».

Артемизинин (Qinghaosu) – природный пероксид, обладающий высокой противомалярийной активностью. Есть еще кое-что, что делает его важным лекарственным препаратом, но об это – в самом конце. Артемизинин был выделен в 1971 году из полыни однолетней (Artemisia annua) в рамках программы под названием “Project 523”, запущенной китайским правительством в 1967 году. Каждый из нас видел эту полынь, но только содержание в ней артемизинина очень и очень разное. Например, были исследованы 120 образцов, собранных в различных районах, показанных на Рис.1.

Рисунок 1

Pic1.png

 

 

Содержание артемизинина в сухом растении достигало 3% (биоэкотип Gu5 Guilan-Khorma village), у 12 биоэкотипов содержание варьировало от 2 до 3%, у 47 биоэкотипов – от 1 до 2%, у 20 биоэкотипов – от 0.5 до 1% и оставшийся 41 биоэкотип содержал менее 0.5% артемизинина в сухом растении. Это очень большие цифры, полынь Artemisia annua из Китая содержит значительно меньше артемизинина от 0.01% до 0.50% очень редко до 1% на сухой вес растения.

Представляете, да? Сено накоси, сено собери, сено высуши, ну, а потом экстракция артемизинина из растения с помощью диэтилового эфира, гексана, петролейного эфира или бензола и т.д.. Процессы давно и хорошо известны, т. е. обладает гарантированной «патентной чистотой» (Россия и СНГ), или «патентной неуязвимостью» (ЕС), или «свободой от охраняемых патентных прав» (США) и др.

Но все равно, количества артемизинина, которое можно экстрагировать из травы мало. Дополнительные количества можно получить через артемизининовую кислоту, которой в растении примерно в 5-10 раз больше чем артемизинина, поэтому ее извлечение из жидких отходов после экстракции возможно без хроматографии, а о ее переработке в артемизинин будет чуть ниже. Стоит сказать, что того количества артемизинина, которое экстрагируют из травы недостаточно, чтобы обеспечить мировой противомалярийный спрос. Иными словами, невозможно покрыть мировую потребность только за счет имеющегося растительного сырья без генной модификации.

Для увеличения количества доступного сырья при прямом выделении артемизинина существуют и используются методы:

·  Нетрансгенные – это селекция на основе природной полыни и выращивание культур в пробирке, кстати, этот путь рассматривается биотехнопарком Кольцово, как приоритетный;

· Трансгенные – это клонирование биосинтетических генов артемизинина в Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, что дало шанс крупномасштабному микробному производству предшественников артемизинина, таких как аморфа-4,11-диен и артемизининовая кислота.

А теперь следите за руками, именно для этого мы с вами и отвлекались. У нас имеется артемизининовая кислота, как отход после экстракции «сена» и артемизининовая кислота, полученная с помощью инженерных штаммов дрожжей. И ту, и другую надо превратить в артемизинин по схеме на Рис. 2. Так как тут начинается сплошная химия, то сделать это достаточно несложно, но выход артемизинина исходного продукта, конечно, не для слабонервных переработчиков нефти и газа.

Первый шаг – это гидрирование артемизининовой кислоты до дигидроартемизининовой кислоты на катализаторах родиевых, или борогидратных, или диимидных. Выход составляет до 99% при использовании родиевых катализаторов и более 90% при использовании диимидных.

Рисунок 2

Pic2.png

 

Второй шаг – это дигидроартемизининовую кислоту пероксидированием переводят в артемизинин, одним из методов:

·  Окислением кислородом в среде дихлорметана при низкой температуре и облучении ультрафиолетом. Выход артемизинина составляет 24%-39% при двух стадиях;

·  Окислением кислородом в среде диазометана при низкой температуре и облучении ультрафиолетом. Выход артемизинина составляет 20% при четырех стадиях;

·  Окислением кислородом в среде ацетона при комнатной температуре и облучении ультрафиолетом. Выход артемизинина достигает 30%, при пяти стадиях;

·    Окислением кислородом из концентрированной перекиси водорода под действием молибдата натрия, в среде метанола. Выход артемизинина достигает 40% при трех стадиях;

Любой из перечисленных способов гидрирования и пероксидирования может быть реализован в промышленном процессе, как, например, от компании Sanofi, имеющем выход артемизина до 55% от исходной артемизининовой кислоты. Каталитическое восстановление артемизининовой кислоты водородом дает смесь энантиомеров, которые преобразуются в смешанные ангидриды в системе этилхлорформиат-карбонат калия. Смешанные ангидриды при облучении ультрафиолетом в среде дихлорметана с использованием тетрафенилпорфирина как фотосенсибилизатора, и трифторуксусной кислоты как инициатора, проходят каскад реакций – расщепление по Хоку, дополнительное оксигенирование, циклизация.

Использование инженерного штамма дрожжей, содержащих необходимые гены полыни в сочетании с усилением регулирования терпенового пути из тростникового сахара получают аморфа-4,11-диен являющийся биогенетическим предшественником артемизинина, Рис. 3. Далее начинается обычная химия, т.е. все ясно и понятно из аморфадиена – артемизининовая кислота, а из нее артемизинин, о двух шагах мы уже говорили. Выход артемизинина достигает 30% при девяти стадиях.

Рисунок 3

Pic3.png

 

Обратите внимание, что на Рисунке 3 показана боковая ветвь – это фарнезены или ациклические сесквитерпены – чрезвычайно востребованные продукты. Но отвлекаться на них не будем, сами читайте.

Считается (с точки зрения диверсификации рисков), что при промышленном производстве выгодно поддерживать соотношение 40:60 по выпуску артемизинина, получаемого методом прямого выделения из растений (включая артемизинин, полученный из жидких отходов экстракции), и выпуску артемизинина, получаемого из трансгенных аморфа-4,11-диена или артемизиновой кислоты.

В принципе, мы с вами все сделали и получили артемизинин, однако терапевтическая ценность артемизинина ограничена низкой растворимостью как в масле, так и в воде, что привело к развитию полусинтетических препаратов с фармакологическими свойствами, превосходящими таковые у родителя. Важнейшими производными являются: артеметер, артеетр и артесунат, проявляющие большую активность, чем сам артемизинин, и имеющие улучшенную растворимость, благоприятный обмен веществ и гидролитическую стабильность. Известны модульные процессы в проточных или периодических реакторах при комнатной температуре, ведется окислением кислородом артемизининовой кислоты и облучении ультрафиолетом в среде трифторуксусной кислоты. Выход артемизинина достигает 39% на потоке. Полученный артемизинин восстанавливается борогидридом натрия в среде этанола до дигидроартемизинина, а далее технологическая схема состоит из трех взаимосвязанных модулей для получения из дигидроартемизинина: артеметра, артеетра и артесуната. Очистка продуктов с помощью градиентной колоночной хроматографии производится в четвертом модуле. Выход артеметра достигает 25% и артесуната 48% от количества дигидроартемизинина. Переработка дигидроартемизинина до артеметра, артеетра и артесуната с использованием каталитических систем и таких растворителей, как толуол, возможна и в совершенно независимых блоках, что делается гораздо чаще, чем в сборных модулях.

«А нельзя ли все тоже самое, но без посевной, сбора урожая, а также без микробов», спросил мой ближневосточный коллега, до сих пор отлично говорящий на русском языке. Ну то есть чтоб без тракторов, а все делалось в чистом белом цеху. Нельзя. Вернее, можно, но уж очень долго, да и выходы на сырье малюсенькие. Ниже я привожу стартовое вещество для таких чисто синтетических методов, процент выхода артемизинина и количество стадий:

Полные химические синтезы артемизинина с использованием веществ:

- изопулегол (Isopulegol), доступный терпеновый спирт (5%, 14 стадий), 1983 год

- R-цитронеллал (citronellal) (0,2%, 21 стадия), 1986 год

- 3-карен (3-Carene), доступный терпен, (6%, четыре стадии), 1989 год

- (+) -изолимонен (isolimonene), получают нагреванием 2-карена (0,3%, 12 стадий)

- циклогексанон (cyclohexenone) (9%, 9 стадий), 1987 год

- метилциклогексанон (R-methylcyclohexanone) (10%, 10 стадий), 1987 год

- R-пулегон (рulegone) (3.5%, 14 стадий), 1992 год

- ментол (menthol) (0.9%, 15 стадий)

Полные химические синтезы дигидроартемизининовой кислоты или ее метилового эфира с использованием исходных веществ:

- β-пинен, (12%, 17 стадий)

- изопулегол, (15%, 9 стадий)

- R-цитронеллал, (4%, 8 стадий)

В заключение то, о чем обещал сказать в начале: с недавних пор у артемизинина активно исследуется противоопухолевую активность. Если она будет подтверждена на терапевтически значимом уровне, интерес к этому препарату может вырасти еще значительнее. А при текущем положении дел это будет означать немедленный рост и без того высоких цен на него.